《人乳头瘤病毒E6E7基因重组腺病毒的构建及鉴定》

人乳头瘤病毒E6E7基因重组腺病毒的构建及鉴定

【关键词】人类乳头状瘤病毒，人；腺病毒科

constructionandidentificationofrecombinantadenovirusescarryinghpv16e6e7

【abstract】aim：toconstructthereplicationdeficientrecombinantadenovirusescarryinghumanpapillomavirus16（hpv16）e6e7andidentifythevectorwithwesternblot.methods：thehpv16e6e7genefragmentwasobtainedfromtheplasmidpet32a（+）e6e7byamplificationanddigestion，andtheshuttleplasmidpadtrackcmve6e7inwhichthee6e7wasinsertedintothedownstreamofcmvpromoterwasestablishedbyligation.thenthelinearizedshuttleplasmidwascotransformedintobj5183bacteriawithbackbonevectoradeasy1toobtaintherecombinantadenoviralplasmidpade6e7byhomologousrecombination.therecombinedadenovirusdnawastransfectedinto293cellsforpackingandtheamplificationproductofreplicationdeficientade6e7viruswaspurifiedbycscldensitygradientcentrifugation.theexpressionofe6e7wasverifiedbywesternblotin293cellafterinfectedwithade6e7.results：therecombinantplasmidpade6e7wasestablishedbyhomologousrecombinationandconfirmedbyrestrictionendonucleasedigestionandsequencing.gfpexpressioncouldbeobserved3dafterpackingofthelinearizedpade6e7in293cellsand6.9×1010pfu/ltiterofade6e7wasobtainedbycsclgradientpurification.the293cellwasinfectedwiththistiterofade6e7viruses，andthentotalproteinin293cellswasextracted.westernblotshowedthate6e7proteinwasexpressedobviously.conclusion：ade6e7expressingbothgfpande6e7simultaneouslycanbesimplyandrapidlygeneratedbyusingtheadeasysystem.

【keywords】papillomavirus，human;adenoviridae

【摘要】目的：利用adeasy系统构建人乳头瘤16（hpv16）e6e7基因重组腺病毒，并通过westernblot方法检测e6e7蛋白的表达.方法：将质粒pet32a（+）e6e7扩增、酶切获得e6e7片段插入腺病毒穿梭载体质粒padtrackcmv的巨细胞病毒（cmv）启动子下游，构建重组穿梭载体padtrackcmve6e7，线性化后与骨架载体adeasy1在细菌bj5183内同源重组得到腺病毒质粒pade6e7，经人胚肾293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒ade6e7；用包装后的病毒上清再次感染293细胞，提取细胞中的蛋白，通过westernblot方法检测e6e7蛋白的表达.结果：连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pade6e7；经人胚肾293细胞包装，3d后观察到绿色荧光蛋白（gfp）明显表达，氯化铯梯度离心纯化最终获得6.9×1010pfu/l滴度的重组病毒；用该滴度的ade6e7重新感染人胚肾293细胞3d后，提取细胞蛋白，westernblot检测，e6e7有明显表达.结论：利用新型腺病毒载体adeasy系统可在短期内制备同时表达gfp和e6e7的重组腺病毒ade6e7.

【关键词】人类乳头状瘤病毒，人；腺病毒科

0引言

高危型人类乳头瘤状病毒（hpv16，18）与宫颈癌的发病密切相关［1］.hpv编码了多种癌蛋白（e1，e5，e6，e7等）其中以e6，e7为主，他们都能诱导细胞永生化，引起细胞的永生.复制缺陷型重组腺病毒（replicationdeficientrecombinantadenovirus）是目前基因治疗最常用的载体之一［2］，我们利用adeasy系统构建了外源插入hpv16e6e7片段的复制缺陷性腺病毒ade6e7，并观察了ade6e7感染293细胞，为研究hpv16e6e7在女性宫颈癌中的作用提供新的手段.

1材料和方法

1.1材料穿梭质粒padtrackcmv，骨架质粒padeasy1，仅插入gfp的对照重组腺病毒质粒padgfp，大肠杆菌bj5183由重庆医科大学肝病研究所惠赠；293细胞、e.coli，dh5a由本实验室保存.pet32a（+）e6e7载体已构建成功.pmeⅠ，pacⅠ限制性内切酶购自基因公司；bglⅡ，hindⅢ限制性内切酶、连接试剂盒、dna小量胶回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品；lipofectamintm2000脂质体转染试剂盒购自roche公司，dmem培养基及胎牛血清购自hyclon公司；蛋白marker购自tiangene公司；驴抗鼠的e6单克隆抗体购自santacruz公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠的e6二抗及dab显色系统购自北京中山公司.

1.2方法bglⅡ和hindⅢ分别双酶切腺病毒穿梭质粒padtrackcmv和pet32a（+）e6e7，凝胶回收e6e7片段和线性化的padtrackcmv，连接（16℃，8h），转化dh5a感受态细菌，在卡那酶素抗性的lb平板上培养过夜，挑选转化的菌落，提取质粒，bglⅡ和hindⅢ双酶切鉴定阳性克隆，同时送上海生物工程公司测序分析.提取padtrackcmve6e7质粒，取1μg用pmeⅠ线性化，胶回收线性化的padtrackcmve6e7质粒，转化到含有腺病毒基因组质粒adeasy的bj5183感受态细胞中［3］，在卡那酶素抗性的lb平板上培养16～24h，挑选较小的菌落培养，抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳初筛重组体，再用pacⅠ酶切鉴定.pacⅠ线性化ade6e7，乙醇、醋酸钠沉淀，700ml/l乙醇漂洗后重新溶解在20μl灭菌的去离子水中.配制a液（质粒dna4μg+无血清dmem至250μl）和b液（10μllipofectamintm2000以无血清dmem稀释至250μl），a，b混合，37℃反应2h.pbs漂洗细胞后每孔加入2ml无血清培养液，将混合物轻倾于培养孔中轻轻混合，继续培养8h后更新完全培养基，直至90%以上293细胞出现病变（cytopathiceffect，cpe）.收集上清继续感染293细胞以扩增病毒.用氯化铯密度梯度离心法纯化重组重组腺病毒ade6e7.收集后的病毒层，0.22μm无菌过滤后小份分装，-80℃保存.trizol试剂提取重组腺病毒感染293细胞和未感染293细胞的rna取1μg细胞总rna进行逆转录反应，总反应体积为50μl，37℃反应1h，95℃5min，灭活逆转录酶.pcr扩增e6e7片段的上游引物pf：5＇cgggatccatggaaaccggttagtataaa3＇，下游引物pr：5＇cgggatcccatggtagattatggtt3＇.反应条件：95℃变性5min，95℃30s，58℃30s，72℃1min，30个循环，72°c延伸10min.ripa提取ade6e7感染293细胞和未感染293细胞的总蛋白，变性后做sdspage电泳，转膜，条件为6v恒压，

3.5h.驴抗羊的e6单抗、hrp标记的二抗，杂交反应后dab显色.根据文献［3］用已获得的重组腺病毒感染hek293细胞，得到扩增的病毒粗提液，将病毒粗提液进行对数稀释，通过终点稀释试验计算病毒滴度.终点稀释实验中滴度计算公式：病毒滴度（pfu/l）=104（x+0.8），x为各行阳性率总和.

2结果

2.1腺病毒穿梭载体padtrackcmve6e7的构建和鉴定用bglⅡ和hindⅢ分别双酶切腺病毒穿梭质粒padtrackcmv，pet32a（+）e6e7和padtrackcmve6e7质粒（图1），可以获得860bp的e6e7基因和8.9kb的padtrackcmv.

1：marker：λhindⅢ;2：padtrackcmv/bglⅡ，hindⅢ;3：pet32e6e7/bglⅡ，hindⅢ;4：padtrackcmve6e7/bglⅡ，hindⅢ;5：marker：2000.

图1腺病毒穿梭载体padtrackcmve6e7鉴定（略）

2.2e6e7重组腺病毒基因组质粒的构建和鉴定同时将padtrackcmve6e7质粒和padtrackcmv空质粒用pmeⅠ线性化后，转化到含有adeasy1的bj5183感受态细菌中，与其内的adeasy1进行同源重组.pacⅠ酶切后，可见4.5kb和23kb处各有1个条带（图2）.

［5］davisar，wivelna，palladinojl，etal.constructionofadenoviralvectors［j］.molbiotechnol，2001，18：63-70.

［6］郑权，黄宗海，汤福祥等.应用两步氯化钙转化法高效制备双自杀基因重组腺病毒［j］.第一军医大学学报，2003，23（6）：575-577.

［7］greenap，huangjj，scottmo，etal.anewscalablemethodforthepurificationofrecombinantadenovirusvectors［j］.humgenether，2002，13：1921-1934.